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2019-04-02
    癌症治疗新契机 循环肿瘤DNA的应用2019-10-18T15:17:14+00:00

    Project Description

    ctDNA 是游离 DNA(cell-free DNA,cfDNA)中的一类,主要来自于坏死或凋亡的肿瘤细胞、肿瘤细胞分泌的外排体

    ◎什么是循环肿瘤 DNA ?

    ctDNA 是游离 DNA(cell-free DNA,cfDNA)中的一类,主要来自于坏死或凋亡的肿瘤细胞、肿瘤细胞分泌的外排体【图 1】。1948 年,Mandel 与 Métais 首 次在人体循环血液中发现含有经细胞代谢产生的游离 DNA。随后在 1977 年,Leon 等人首先用放射免疫分析 显示癌症病人血中含有浓度较高 cfDNA 的研究虽被提 出,但相关应用却是在非侵入性产前检测领域才有较多 重大突破。直到有效分离游离 DNA 技术的出现,和特 殊荧光染色与 PCR 技术相结合的检测技术的应用,使 这一领域的研究在最近二十多年得到了较迅速发展; 在 1994 年,癌症病人的 cfDNA 被检测出含有原发性肿 瘤相关基因的突变型,此些在肿瘤中检测出的肿瘤特异 性遗传改变也可以在癌症患者的血浆 cfDNA 中找到相 同突变型 DNA,被称为循环肿瘤 DNA (circulating tumor DNA;ctDNA)。

    ◎循环肿瘤 DNA 有何临床意义?

    血中游离 DNA 在疾病的早期诊断、预后 、监测等 方面具有重要潜在价值。其具体医学应用大致包括以下 方面:(1) 产前诊断,(2) 免疫性疾病等非肿瘤类疾病的 病情分析与疗效观察,(3) 肿瘤相关分析;在这三类应用 中,尤以在肿瘤分析中的价值最为重要。随后的研究发现与健康人相比,cfDNA 在炎症性如转移性癌症,创伤, 心肌梗塞,自身免疫性疾病和败血症患者中的浓度较高。
    在转移性乳腺癌患者血中有 >90% 机会可侦测到 ctDNA,但是其大小通常为 160-180 碱基对 (bp),所占比 例较低(0.1%-1% 之间),因此检测上难度较高。癌症患 者的血浆含有携带肿瘤突变和肿瘤负荷信息的 ctDNA, 已经证实 ctDNA 与乳腺癌的肿瘤大小,肿瘤分期和淋巴 结转移程度显著相关,并且可以作为癌症的生物标志物, 从诊断到预后及用于监测肿瘤的演变和治疗反应。
    乳腺癌可表现出独特的体细胞突变和基因表现变 化,基因表现变化导致疾病复发和耐药性是造成死亡 的主要因素,因此预测、持续监测对治疗和疾病进展 是极重要的。现在医界正在对循环肿瘤 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA) 做广泛研究,特点为它是一种非侵 入性“实时” (real time) 生物标志物,可以在治疗前和 治疗期间提供诊断和预后信息。这些信息包括 DNA 突 变,表观遗传改变和其他形式的肿瘤特异性异常。
    现今癌症诊断和转移监测主要经由组织采样,影像 成像或再次对怀疑转移病灶进行组织生检。活体组织生 检是一种有伤害性的手术,仅限于某些部位才有办法执 行,在临床实务中并非任何处所都可进行。为了真正掌 握疾病变化和避免危险又痛苦的组织生检过程,液体切 片检查 (liquid biopsy) 可能代表一种新的且具价值性的 检验方法;检验血液的循环生物标志物,包括循环肿瘤细胞(CTC)、ctDNA、循环 RNA 和 miRNA 以克服侵入性组织生检的缺点。

    ◎如何检测循环肿瘤 DNA(ctDNA) ?

    为了检测 cfDNA 中的变体体细胞突变,已经开发 了许多方法。通常它们可以分为两种方法:基于数字 PCR(dPCR)的方法,例如 BEAMing(珠子,乳剂,扩 增和磁性)和微滴式数字 PCR(ddPCR)以及基于次世 代定序(next generation sequence;NGS)的方法。这两 种方法都有优点和局限性,并且每种方法都可能在未来 的临床医学中找到自己的定位。

    (1) 基于数字 PCR(dPCR)的方法

    可以检测点突变,拷贝数变异,杂合性缺失和非整 倍性。BEAMing:第一代 dPCR 技术将乳液 PCR 与磁珠和流式细胞仪结合起来,以鉴定和定量在较大的正常或 野生型 DNA 分子群体中发现的稀有遗传分子。微滴式 数字 PCR(ddPCR):基于乳液及 dPCR 技术的变体, 对突变检测敏感且特异。ddPCR 极其敏感,然而它仅能 够在单测定中评估有限数量的碱基对改变,因此 ddPCR 目前只能用于热点突变检测,不能应用于突变发现。

    (2)  基于 NGS 的方法

    NGS 是大规模并平行地连续鉴定小片段 DNA 的基 础,明确知悉肿瘤突变信息可以预测临床预后并引导肿 瘤演变的标靶治疗方向。然而传统的 NGS 方法对于检 测 ctDNA 突变不够敏感。随着技术的发展,二代测序 (NGS)技术的成熟,已大大提高 NGS 灵敏度,提高了 ctDNA 检测的灵敏度和准确度,加速推进 ctDNA 检测应 用于临床。
    除了上面提到的所有方法之外,还有其他技术用于特异性检测,例如 DNA 甲基化和微卫星改变。总之与非肿瘤 cfDNA 相比,DNA 分析技术的快速发展使得检 测相对低浓度的 ctDNA 成为可能。

    ◎循环肿瘤 DNA 在乳腺癌的临床应用

    ctDNA 检测对临床实务的应用是广泛的,有助于监测 疾病进展并确定合理的治疗方法,乳腺癌临床应用如下:

    (1) 诊断和筛检

    文献已经证实实体瘤患者的中位数循环血浆 DNA 浓度,比健康志愿者高 3 倍。因此癌症患者血浆中的游 离 DNA 被引入作为癌症检测和监测的工具,许多研究 都集中在其筛选价值上。通过血液中的荧光测定可以容 易地检测 cfDNA,尽管在 cfDNA 的平均值上癌症患者 和健康人之间存在差异,但是显著的重迭使得难以充当 诊断工具,将早期乳腺癌与健康患者区分开来的能力较 低,使得这种方法不太可能在临床上有用。

    (2)监测疾病负荷和预测预后

    在2013年由 Sarah – Jane Dawson博士等人对 ctDNA 进行了深入研究,ctDNA 被证明是监测正在接受 全身治疗的转移性乳腺癌患者肿瘤负荷动态的可靠工 具。分析 ctDNA 携带肿瘤特异性改变的应用价值,并将 其与乳腺癌中的其他循环生物标志物进行比较。他们发现相较于 CA 15-3 与 CTC,ctDNA 与肿瘤负荷的变化有 较大的动态范围和更大的相关性【图 2】。

    (3) 预测对治疗的反应

    突变经常在接触治疗后变得明显,乳癌常见的是雌 激素受体 -α 基因(ESR1)。譬如在乳腺癌中 ESR1 突 变可以发生于先前使用芳香酶抑制剂乳癌患者,而影响 标准内分泌治疗的疗效。医学博士 Debu Tripathy 论点,ESR1 突变使雌激素受体具有组成型活性,因此对内分泌治疗不敏感,但可能对雌激素受体下调因子如法洛德 (Faslodex)产生反应。临床试验显示法洛德(Faslodex) 能有效于治疗 ESR1 突变患者,比芳香酶抑制剂的无 进展生存期增加一倍。在生存分析中,增加 cfDNA 中 ESR1 突变可预测较差的内分泌治疗疗效,监测 ctDNA 中的复发性 ESR1 突变能对患者治疗或预后提供相关预测信息有用的方法。

    (4) 追踪克隆进化和抗性预测

    乳癌治疗中的普遍挑战是出现对治疗的抗性,特别 是对于转移性乳腺癌。在化学治疗、内分泌治疗和标靶 等治疗下,癌细胞可以随着时间的推移而发展,获得和 失去基因改变。重复组织生检以研究克隆进化作为治疗 的结果是困难的,侵入性的检查也可能由于肿瘤内异质 性而困扰。此外一些转移部位无法进行组织生检,例如 脑转移和身体深处的一些内脏转移。相反 ctDNA 的系列 分析可以帮助我们通过简单地定期抽血来追踪克隆进化 并预测抗药性的存在。

    ◎结论和观点

    许多遗传和表观遗传改变在癌症发生和肿瘤进展中 非常重要,其中一些也可以 ctDNA 在血浆和血清中的中 检测到。ctDNA 对肿瘤体细胞重组具敏感性与特异性, 可作为乳癌患者的“液体活检”。因为单独 ctDNA 分 析但缺乏组织生检仍不足以进行癌症诊断,因此未来 ctDNA 在诊断领域的应用仍有很大的研究空间。虽然到 目前为止,在 ctDNA 分析领域已经取得了重大进展,特 别是那些基于 NGS 定序技术,但仍需要进行技术的持 续改进以保证分析的有效性。临床实务的应用更等待严 格的前瞻性临床试验来导引,这样才能嘉惠患者并真正 受益于 ctDNA 应用的信息。
    文 / 台北医学大学台北癌症中心副院长暨附设医院乳房医学中心主任 杜世兴