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2019-04-02
    癌症治療新契機 循環腫瘤DNA的應用2019-10-15T17:18:26+00:00

    Project Description

    ctDNA 是游離 DNA(cell-free DNA,cfDNA)中的一類,主要來自於壞死或凋亡的腫瘤細胞、腫瘤細胞分泌的外排體

    ◎什麼是循環腫瘤 DNA ?

    ctDNA 是游離 DNA(cell-free DNA,cfDNA)中的一類,主要來自於壞死或凋亡的腫瘤細胞、腫瘤細胞分泌的外排體【圖 1】。1948 年,Mandel 與 Métais 首 次在人體循環血液中發現含有經細胞代謝產生的游離 DNA。隨後在 1977 年,Leon 等人首先用放射免疫分析 顯示癌症病人血中含有濃度較高 cfDNA 的研究雖被提 出,但相關應用卻是在非侵入性產前檢測領域才有較多 重大突破。直到有效分離游離 DNA 技術的出現,和特 殊螢光染色與 PCR 技術相結合的檢測技術的應用,使 這一領域的研究在最近二十多年得到了較迅速發展; 在 1994 年,癌症病人的 cfDNA 被檢測出含有原發性腫 瘤相關基因的突變型,此些在腫瘤中檢測出的腫瘤特異 性遺傳改變也可以在癌症患者的血漿 cfDNA 中找到相 同突變型 DNA,被稱為循環腫瘤 DNA (circulating tumor DNA;ctDNA)。

    ◎循環腫瘤 DNA 有何臨床意義 ?

    血中游離 DNA 在疾病的早期診斷、預後 、監測等 方面具有重要潛在價值。其具體醫學應用大致包括以下 方面:(1) 產前診斷,(2) 免疫性疾病等非腫瘤類疾病的 病情分析與療效觀察,(3) 腫瘤相關分析;在這三類應用 中,尤以在腫瘤分析中的價值最為重要。隨後的研究發現與健康人相比,cfDNA 在炎症性如轉移性癌症,創傷, 心肌梗塞,自身免疫性疾病和敗血症患者中的濃度較高。

    在轉移性乳腺癌患者血中有 >90% 機會可偵測到 ctDNA,但是其大小通常為 160-180 鹼基對 (bp),所占比 例較低(0.1%-1% 之間),因此檢測上難度較高。癌症患 者的血漿含有攜帶腫瘤突變和腫瘤負荷信息的 ctDNA, 已經證實 ctDNA 與乳腺癌的腫瘤大小,腫瘤分期和淋巴 結轉移程度顯著相關,並且可以作為癌症的生物標誌物, 從診斷到預後及用於監測腫瘤的演變和治療反應。

    乳腺癌可表現出獨特的體細胞突變和基因表現變 化,基因表現變化導致疾病復發和耐藥性是造成死亡 的主要因素,因此預測、持續監測對治療和疾病進展 是極重要的。現在醫界正在對循環腫瘤 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA) 做廣泛研究,特點為它是一種非侵 入性“即時” (real time) 生物標誌物,可以在治療前和 治療期間提供診斷和預後信息。這些信息包括 DNA 突 變,表觀遺傳改變和其他形式的腫瘤特異性異常。

    現今癌症診斷和轉移監測主要經由組織採樣,影像 成像或再次對懷疑轉移病灶進行組織生檢。活體組織生 檢是一種有傷害性的手術,僅限於某些部位才有辦法執 行,在臨床實務中並非任何處所都可進行。為了真正掌 握疾病變化和避免危險又痛苦的組織生檢過程,液體切 片檢查 (liquid biopsy) 可能代表一種新的且具價值性的 檢驗方法;檢驗血液的循環生物標誌物,包括循環腫瘤細胞(CTC)、ctDNA、循環 RNA 和 miRNA 以克服侵入性組織生檢的缺點。

    ◎如何檢測循環腫瘤 DNA(ctDNA) ?

    為了檢測 cfDNA 中的變體體細胞突變,已經開發 了許多方法。通常它們可以分為兩種方法:基於數字 PCR(dPCR)的方法,例如 BEAMing(珠子,乳劑,擴 增和磁性)和微滴式數字 PCR(ddPCR)以及基於次世 代定序(next generation sequence;NGS)的方法。這兩 種方法都有優點和局限性,並且每種方法都可能在未來 的臨床醫學中找到自己的定位。

    (1) 基於數字 PCR(dPCR)的方法

    可以檢測點突變,拷貝數變異,雜合性缺失和非整 倍性。BEAMing:第一代 dPCR 技術將乳液 PCR 與磁珠和流式細胞儀結合起來,以鑑定和定量在較大的正常或 野生型 DNA 分子群體中發現的稀有遺傳分子。微滴式 數字 PCR(ddPCR):基於乳液及 dPCR 技術的變體, 對突變檢測敏感且特異。ddPCR 極其敏感,然而它僅能 夠在單測定中評估有限數量的鹼基對改變,因此 ddPCR 目前只能用於熱點突變檢測,不能應用於突變發現。

    (2) 基於 NGS 的方法

    NGS 是大規模並平行地連續鑑定小片段 DNA 的基 礎,明確知悉腫瘤突變資訊可以預測臨床預後並引導腫 瘤演變的標靶治療方向。然而傳統的 NGS 方法對於檢 測 ctDNA 突變不夠敏感。隨著技術的發展,二代測序 (NGS)技術的成熟,已大大提高 NGS 靈敏度,提高了 ctDNA 檢測的靈敏度和準確度,加速推進 ctDNA 檢測應 用於臨床。

    除了上面提到的所有方法之外,還有其他技術用於特異性檢測,例如 DNA 甲基化和微衛星改變。總之與非腫瘤 cfDNA 相比,DNA 分析技術的快速發展使得檢 測相對低濃度的 ctDNA 成為可能。

    ◎循環腫瘤 DNA 在乳腺癌的臨床應用

    ctDNA 檢測對臨床實務的應用是廣泛的,有助於監測 疾病進展並確定合理的治療方法,乳腺癌臨床應用如下:

    (1) 診斷和篩檢

    文獻已經證實實體瘤患者的中位數循環血漿 DNA 濃度,比健康志願者高 3 倍。因此癌症患者血漿中的游 離 DNA 被引入作為癌症檢測和監測的工具,許多研究 都集中在其篩選價值上。通過血液中的熒光測定可以容 易地檢測 cfDNA,儘管在 cfDNA 的平均值上癌症患者 和健康人之間存在差異,但是顯著的重疊使得難以充當 診斷工具,將早期乳腺癌與健康患者區分開來的能力較 低,使得這種方法不太可能在臨床上有用。

    (2) 監測疾病負荷和預測預後

    在2013年由 Sarah – Jane Dawson博士等人對 ctDNA 進行了深入研究,ctDNA 被證明是監測正在接受 全身治療的轉移性乳腺癌患者腫瘤負荷動態的可靠工 具。分析 ctDNA 攜帶腫瘤特異性改變的應用價值,並將 其與乳腺癌中的其他循環生物標誌物進行比較。他們發現相較於 CA 15-3 與 CTC,ctDNA 與腫瘤負荷的變化有 較大的動態範圍和更大的相關性【圖 2】。

    (3) 預測對治療的反應

    突變經常在接觸治療後變得明顯,乳癌常見的是雌 激素受體 -α 基因(ESR1)。譬如在乳腺癌中 ESR1 突 變可以發生於先前使用芳香酶抑製劑乳癌患者,而影響 標準內分泌治療的療效。醫學博士 Debu Tripathy 論點,ESR1 突變使雌激素受體具有組成型活性,因此對內分泌治療不敏感,但可能對雌激素受體下調因子如法洛德 (Faslodex)產生反應。臨床試驗顯示法洛德(Faslodex) 能有效於治療 ESR1 突變患者,比芳香酶抑製劑的無 進展生存期增加一倍。在生存分析中,增加 cfDNA 中 ESR1 突變可預測較差的內分泌治療療效,監測 ctDNA 中的復發性 ESR1 突變能對患者治療或預後提供相關預測信息有用的方法。

    (4) 追踪克隆進化和抗性預測

    乳癌治療中的普遍挑戰是出現對治療的抗性,特別 是對於轉移性乳腺癌。在化學治療、內分泌治療和標靶 等治療下,癌細胞可以隨著時間的推移而發展,獲得和 失去基因改變。重複組織生檢以研究克隆進化作為治療 的結果是困難的,侵入性的檢查也可能由於腫瘤內異質 性而困擾。此外一些轉移部位無法進行組織生檢,例如 腦轉移和身體深處的一些內臟轉移。相反 ctDNA 的系列 分析可以幫助我們通過簡單地定期抽血來追踪克隆進化 並預測抗藥性的存在。

    ◎結論和觀點

    許多遺傳和表觀遺傳改變在癌症發生和腫瘤進展中 非常重要,其中一些也可以 ctDNA 在血漿和血清中的中 檢測到。ctDNA 對腫瘤體細胞重組具敏感性與特異性, 可作為乳癌患者的“液體活檢”。因為單獨 ctDNA 分 析但缺乏組織生檢仍不足以進行癌症診斷,因此未來 ctDNA 在診斷領域的應用仍有很大的研究空間。雖然到 目前為止,在 ctDNA 分析領域已經取得了重大進展,特 別是那些基於 NGS 定序技術,但仍需要進行技術的持 續改進以保證分析的有效性。臨床實務的應用更等待嚴 格的前瞻性臨床試驗來導引,這樣才能嘉惠患者並真正 受益於 ctDNA 應用的信息。

    文 / 臺北醫學大學臺北癌症中心副院長暨附設醫院乳房醫學中心主任 杜世興